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[宏基因组] 研究经典案例,学习高分多组学文章思路

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    发表于 2020.1.17 09:46:22 | 显示全部楼层 |阅读模式
    本期推送为系列第四期,前三期文章可点击文末“拓展阅读”。经过前几期的学习,大家对微生物群落研究的组学类型、基础分析内容、组学关联思路方法已经有了一定的积累,本期微信文章,我们将分享16S+宏基因、16S+宿主转录两种类型多组学关联分析的应用,解读研究思路。
    案例1  组学互补验证型[1]

    2019 Science of the Total Environment
    IF=5.589


    背景:有害水藻爆发通常以蓝藻聚集体(Cyanobacterial Aggregates,CAs)的爆发为特征,是淡水湖泊面临的严重威胁。推测CAs中蓝藻与细菌的共生有利于彼此稳定,研究其共生的关联作用,可为以扰乱CAs平衡为突破口治理水华的思路提供参考。

    实验:按年度周期,采集太湖的CAs样品,共26个,16S V4区测序、宏基因组测序。

    关联思路:16S与宏基因组物种分析的一致性验证。

    图1 16S+宏基因组 案例研究思路

    文章思路:
    如图1,根据CAs的优势物种特征,将样本分为两组(DCA:长胞藻属的聚集体;MCA:微胞藻属的聚集体)。首先基于16S数据进行菌群结构分析,初步了解两种CAs中物种的丰富程度,发现MCA物种丰富程度更高。然后具体到物种层面,分析不同CAs物种组成特征,发现门水平物种组成相似。

    随后文章对16S和宏基因组两组学的结果进行一致性验证,如图2,饼图表示16S(左)和宏基因组(右)测序中,各物种分类在所有样本中的丰度均值,即图例中的百分比,计算图例中两列数据的spearman相关系数,大于0.85,属于强相关,暗示16S与宏基因组测序结果的一致性。

    图2 16S+宏基因关联分析结果示例

    作者之后进行了聚集体功能差异、富集分析、共代谢网络分析,并开展了物种、功能与环境因子的关联分析(图3)。通过环境因子关联分析,再次将16S与宏基因组数据进行对比验证。

    由16S测序获得的OTU和宏基因组测序获得的mOTU丰度矩阵分别与每个环境因子进行mantel test分析,发现二者均与溶氧、总氮、总磷等显著相关,暗示两组学结果较高的一致性。
    但是宏基因组的功能与环境因子关联结果有一定的差异,暗示物种与功能对环境变化不同的响应。

    图3 16S和宏基因与环境因子关联分析

    最后基于总氮的显著影响,研究基于binning进行了群落基因组上N循环功能特征基因的分析,揭示了细菌与蓝藻共同构成N循环过程的关联,说明了水藻爆发过程细菌与蓝藻的相互作用。

    案例2 组学间关联预测型[2]


    2018 American journal of respiratory and critical care medicine
    IF=12.996


    背景:肺癌是发病率和死亡率增长最快,对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一,吸烟是一个公认的危险因素,但只有15%的吸烟者会患肺癌。越来越多的证据表明肺部微生物可能在癌症的发病机制中起作用。

    实验:肺癌组(n=39,诊断为肺癌)、疾病对照组(n=36,良性肺结节)、健康对照组(n=10)(从未吸烟者,经支气管镜检查表明无呼吸道症状、胸部X射线异常、肺部疾病)。收集患病组织和健康组织下气道样本(含支气管上皮细胞),进行16S V4区,RNA-seq分析。

    关联思路:物种与宿主基因表达的关系预测

    图4 16S+宿主转录 案例研究思路  

    文章思路:微生物角度,基于16S测序,分析发现患病样本与健康样本中,微生物菌群结构、物种组成有显著差异。Lefse分析发现患病样本中Streptococcus, Veillonella等5个物种显著富集。宿主角度,基于转录组测序,分析发现患病样群体中Hippo、TNF、Toll样受体、T细胞受体、B细胞受体、上皮细胞细菌侵袭、PI3K/AKT和ERK/MAPK信号通路显著富集。

    然后基于物种丰度,将物种聚类分为2个cluster(健康组的高丰度物种与患病组高丰度物种),挑选患病组的物种与pathway、基因进行相关系数分析,再挑选强相关的关系对绘制网络图(图5)。

    图5 物种与pathway相关性网络图

    图中方框表示pathway、圆形表示物种。圆大小表示物种丰度均值。红线表示正相关、蓝线表示负相关,浅色线表示相关性不显著。从相关性分析结果,发现Veillonella 和 Megasphaera与肺癌发生的ERK和PI3K通路有关。

    通过呼吸道上皮细胞体外暴露于相关菌群的实验,验证了菌群会引起ERK和PI3K通路的上调。最终揭示了Veillonella 和 Megasphaera参与肺癌发生的微生物机制(图6)。但具体影响过程,还有待蛋白组、代谢组学等的分析探索。

    图6 肺癌的微生物发生机制探究

    Tips     
    基迪奥有丰富的DNA、RNA、蛋白、代谢以及表观、10X转录组等多种测序/质谱分析技术,随着项目经验累积,开发汇总了系统完善的多组学分析模型和方法,助力开展更深入细致的多组学探究。有兴趣的小伙伴可以咨询当地销售。

    参考文献
    [1] Zhu C M, Zhang J Y, Guan R, et al. Alternate succession of aggregate-forming cyanobacterial genera correlated with their attached bacteria by co-pathways[J]. Science of The Total Environment, 2019, 688: 867-879.
    [2] Tsay J C J, Wu B G, Badri M H, et al. Airway microbiota is associated with upregulation of the PI3K pathway in lung cancer[J]. American journal of respiratory and critical care medicine, 2018, 198(9): 1188-1198.


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    本文作者:基迪奥-小鱼儿

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    发表于 2020.2.13 11:53:32 | 显示全部楼层
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