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[其他] DAP-seq——非模式物种转录因子研究的利器

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  • TA的每日心情

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    发表于 2019.4.18 09:20:09 | 显示全部楼层 |阅读模式
    在我们近期的微信文章中,介绍了通过ATAC-seq可以帮助我们从一堆转录因子(transcription factor,TF)中快速锁定核心TF。如果要回顾之前的文章,可以点击下面链接:

    转录组测序之后该做什么?——基因组可接近性会给你线索
    基迪奥七周年,ATAC-seq免费送
    基迪奥Omicshare在线课堂68期:ATAC-seq专题(上)——转录调控研究的新秘钥
    基迪奥Omicshare在线课堂69期:ATAC-seq专题(下)——基于ATAC-seq的高分文章思路解析


    图1 通过基因组开放性研究,可以为下游基因的转录和上游的各类调控建立桥梁。


    图2 通过ATAC-seq的peak区域的TF motif富集分析(A)以及TF motif足迹分析(B)可以快速锁定核心转录因子。 ATAC与motif已知的转录组因子

    可以说,ATAC-seq是一个间接研究转录因子结合区域的技术。当候选TF的结合位点序列(motif)已知,我们就可以在ATAC-seq检测到的开放区检索候选TF的motif,从而根据各个TF的motif出现的频率,来锁定核心TF(图2)。
    当然,如果我们利用包括ATAC-seq在内的各类技术,锁定核心TF后,接下来如果能针对核心TF直接开展研究,并验证ATAC-seq的结果就最好了。 ATAC与motif未知的转录组因子
    ATAC-seq寻找核心TF的基础是目标TF的motif是已知的。如果没有候选TF的motif信息,自然也无法将ATAC-seq检测到的开放区与候选TF关联起来。因此,对于motif未知的TF,优先获得TF的motif序列是非常关键的步骤。 CHIP-seq是最有效的直接研究目标TF结合位点的技术。CHIP-seq通过特定的TF抗体,将与TF结合的DNA片段通过免疫共沉淀(IP)拉取下来,再通过高通量测序,就可以直接检测特定TF在基因组上的结合位点以及分析结合位点的motif(结合位点的特征序列)。
    但是CHIP-seq并非对所有的物种都适用,主要存在以下的一些难点:

    1抗体制备的难点

    人、小鼠等这些常见模式物种的热门转录因子,通常有商业化的CHIP级抗体可以用,开展CHIP-seq还相对容易。但对于非热门转录因子或非模式物种,则无可用的商业化抗体。而制备CHIP级抗体难度大,周期长,是个完全不可控的过程。

    2替代方案的实验周期长

    对于没有抗体的TF,一个替代方案就是构建重组蛋白,即在目标TF序列上接上flag标签序列或者GFP(绿色荧光蛋白)序列。然后通过转基因的手段,将重组后的TF序列导入到细胞或实验动物/植物体内,表达带有FLAG肽段或GFP的TF融合蛋白。然后利用FLAG或GFP的抗体,就可以实现目标TF的CHIP-seq。
    这种方案依然有一个不足:对于某些物种,转基因实验难度很大或周期很长,实验门槛依然很高。 对于以上的CHIP-seq实验的不足,也存在一些体外实验的方法作为替代方案。比较有代表性的是指数富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)和蛋白结合芯片(proteinbinding microarrays ,PBM)。
    这两种方法都是人工合成DNA片段/探针库,然后在体外条件下与目标蛋白(TF)结合。通过对于目标蛋白结合的DNA序列进行检测,获得目标TF的结合位点信息。
    此类方法最大的不足是DNA均为人工合成,没有原始基因组DNA上的修饰信息(例如DNA甲基化)。而DNA甲基化等信息,是影响TF结合的重要因素,所以SELEX、PBM等方法很难还原TF在体内真实的结合情况,与CHIP-seq效果上还有较大差异。


    图3 SELEX的实验步骤

    那么,是否有什么技术可以开展体外实验,但可以得到更加接近体内实验(CHIP-seq)的效果呢?有一个效果优异的方法就是DAP-seq。DAP-seq方法,最早来自一篇cell文章的报道。


    图4 DAP-seq 2016年的cell文章,目前被引用超200次

    DAP-seq的全称是DNA affinity purification sequencing(DNA亲和纯化测序),其实验过程如图5。
    DAP-seq属于类CHIP-seq的体外实实验(图5),基本步骤包括:a)获得基因组DNA,并打断加入测序接头;b)表达连接有磁珠的融合蛋白(目标TF);c)基因组DNA与目标TF融合蛋白一起孵育,利用磁铁富集与目标TF结合的DNA片段,并进行测序。
    但相比之前的体外实验,DAP-seq的优点在于:

    1更接近体内实验

    该方法可以直接使用从细胞中提取的基因组DNA与目标TF结合,从而可以保留基因组DNA修饰(例如,甲基化修饰)的效应,从而更加接近CHIP-seq实验的效果(图5a)。

    2TF结合位点DNA片段的富集过程更加简单


    在表达带有Halo-tag标签的TF后,将Halo-tag标签与带有对应配体的磁珠连接,从而给TF带上了磁性。在后续试验中,采用磁铁吸附的策略,替代了常用的免疫共沉淀策略,从而降低了试验难度。


    图 5 DAP-seq的实验过程

    那么DAP-seq的效果如何呢?在这篇cell文章中,作者分析利用DAP-seq检测到高质量motif的327个TF,发现有248个TF(>75%)对DNA甲基化是敏感的(DNA甲基化高低会影响TF的结合)。这也证明了DAP-seq相比SELEX等技术的优势。
    其次,作者也将部分有标准抗体的TF,进行了CHIP-seq和DAP-seq结果的比较。结果发现两者的peak区域高度一致,且可以获得的motif序列也高度一致(图6)。


    图6 CHIP-seq结果与DAP-seq结果的比较

    小结一下DAP-seq的优点:(1)富集方法(磁珠富集)比传统的IP实验(抗原抗体)简单,所以便于大规模开展;(2)不需要抗体,就可以开展转录因子结合位点研究。这对非模式物种领域,是非常重要的优势。(3)虽然是体外实验,但可以部分保留表观修饰(DNA甲基化)对TF结合的影响。 那么,DAP的方法主要缺点是什么呢?作为一种体外实验,某些缺点是不可避免的。

    1实验成功率较低

    在这篇文章检测的1812个TF中,1055个TF可以检测到peak,529个(大概30%)可以检测到motif。
    失败率高的原因,这篇文章也做了剖析:(1)实验操作导致的失败(做1800多个TF,工作量大,难免会有失误):占10%;(2)蛋白无法在体外表达(例如,编码基因长度太长,难以在体外表达)(3)虽然蛋白成功表达,但TF蛋白依然无法工作。可能原因包括:很多TF在体内起作用必须要有其他配体蛋白的协助,但在体外环境下,缺乏这些条件;体外环境下,蛋白翻译后无法正常折叠或形成多聚物,从而无法行使在体内环境类似的功能……
    对于以上的3点,在我们基迪奥公司的研发试验中也得到了证实。第一个问题,通过优化试验的步骤,几乎可以完全避免。而以上第三点效应的影响,与TF的类型(即TF家族)高度相关。
    在这篇cell文章中,作者也发现某些TF家族的成功率接近100%,某些TF家族的成功率却极低。这一特性,也为我们后续研究提供了参考。如果后续想用DAP-seq研究某个目标TF,则可以先查询在之前的研究中,该TF家族的成功率如何,从而预估目标TF的实验成功率。

    2由于是体外实验,无法研究一些表观修饰的影响


    由于核小体(当然就包含了核小体中组蛋白修饰)等在体外条件下,即容易被蛋白酶解离。因此,DAP-seq无法检测核小体、组蛋白修饰(染色体结构)等对TF作用的影响。但核小体对TF结合的影响,恰恰是ATAC-seq可以检测的。

    因此:DAP-seq + ATAC-seq就是一个完美的解决方案,前者可以检测DNA甲基化的转录调控效应,后者可以检测核小体的转录调控效应,加在一起就可以在体外环境下最大程度地还原CHIP-seq的结果。 那么,你是否有自己关心的TF呢?是否因为是非模式物种或者没有商业化抗体而无法开展CHIP-seq研究呢?DAP-seq + ATAC-seq就是完美的解决方案。如果你对这个解决方案感兴趣,可以留言联系我们。

    本文作者:周老师




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    发表于 2019.4.18 11:28:56 | 显示全部楼层
    点赞,厉害了
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    发表于 2019.4.19 11:03:12 | 显示全部楼层
    讲的特别好,受教了,请问表达halo-tag的载体在哪里能买到?
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    发表于 2019.4.19 19:58:27 | 显示全部楼层
    在体外环境下最大程度地还原CHIP-seq
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    谢谢分享
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    发表于 2019.4.25 10:24:49 | 显示全部楼层
    感谢分享,一直不敢做chip-seq,现在想试试dap
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     楼主| 发表于 2019.4.25 11:09:50 | 显示全部楼层
    0o向日葵o0 发表于 2019.4.25 10:24
    感谢分享,一直不敢做chip-seq,现在想试试dap

    可以联系我们同事
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  • TA的每日心情

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    发表于 2019.12.6 15:14:05 | 显示全部楼层
    我想请教下DAP-seq分析流程,不知可否
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